アミノ酸生合成のための組成物及び方法

专利摘要:
本発明は、一般的に、特に商業的な生物学的生成物、例えばアミノ酸、の産生のために有用な組成物及び方法に関する。より具体的には、本発明は、微生物の遺伝的に改変された株及び商業的生成物の産生のためのその使用に関する。本発明はまた、特に新規単離DNA、核酸、ベクター及び減少したゲノム細菌を提供する。
公开号:JP2011512796A
申请号:JP2010547749
申请日:2009-02-19
公开日:2011-04-28
发明作者:チャン キム，スン；アール． ブラットナー，フレデリック；ヒュン リ，ジュン
申请人:スカラブ ジェノミクス リミティド ライアビリティ カンパニー；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] 発明の分野
本発明は、一般的に、特にアミノ酸のような商業的な生物学的生成物の産生のために有用な組成物及び方法に関する。より具体的には、微生物の遺伝子工学的に改変された株、及び商業的な生成物の産生のためのその使用に関する。本発明はまた、特に新規な単離されたDNA、核酸、ベクター及び減少したゲノム細菌を提供する。]
背景技術

[0002] 関連出願の相互参照
本願は、参照により本明細書に引用されている、2008年2月22日に出願された米国仮出願第61/030,835号の利益を請求する。]
[0003] 発明の概要
1つの実施態様では、本発明は、単離されたDNAであって、そのヌクレオチド配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3もしくは配列番号4又はその相補配列のいずれか1つを含む、DNAを提供する。]
[0004] 別の実施態様では、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3もしくは配列番号4又はその相補配列のいずれか1つを含むあるいはそれから成る、単離されたDNAを提供する。]
[0005] 別の実施態様では、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3もしくは配列番号4（又はその相補配列）のヌクレオチド配列、又はその縮重した変異体を含むあるいはそれから成る、]
[0006] 別の実施態様では、本発明は、発現ベクター、例えば、発現制御配列に作動可能に連結された、配列番号1、配列番号2、配列番号3もしくは配列番号4の核酸を含むプラスミドを提供する。別の実施態様では、本発明は、前記のベクターの1つを含む培養細胞を提供する。更に別の実施態様では、本発明は、前記のベクター又は前記の細胞の子孫の1つでトランスフェクトした培養細胞を提供する。]
[0007] 更に別の実施態様では、本発明は、少なくとも1つの点変異を含むrelA遺伝子を含むゲノムを有する、減少したゲノム細菌、例えばE.コリ(coli）を提供する。関連した態様では、該変異は、relA遺伝子の547又は548の位置にある。]
[0008] 更に別の実施態様では、本発明は、その天然の親株と比べて少なくとも5%、少なくとも8%又は少なくとも10%小さいように遺伝子工学的に作製されるゲノムを有する菌であって、少なくとも1つのrelA変異を含む菌を提供する。1つの実施態様では、該少なくとも1つのrelA変異はrelA遺伝子の位置547又は548に起こる。別の実施態様では、該変異は、relA遺伝子の547の位置でのG→A変異、relA遺伝子の547の位置でのG→T変異、relA遺伝子の548の位置でのC→G変異、又はrelA遺伝子の548の位置でのC→T変異の1以上から選択される。別の実施態様では、該菌は、relA遺伝子の位置540と550との間で起こる、多くない複数、例えば1〜約10、1〜約8又は1〜約5のrelA点変異を含む。]
[0009] 別の実施態様では、本発明は、(1)天然のrelA遺伝子を含むDNAを有する細菌を提供し；(2) 天然relA遺伝子を変異relA遺伝子と置換して、relA変異細菌を形成し；及び (3) 該変異relA細菌からアミノ酸を発現させること、を含む、本明細書に記載の1以上の減少したゲノムを用いてアミノ酸を生合成する方法を提供する。1つの実施態様では、該アミノ酸は、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Val、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr及びTrpからなる群より選択される。]
図面の簡単な説明

[0010] 図1は、MDS42細胞株、スレオニンを産生するように作製されたMDS42細胞株、及びrelA点変異を有するスレオニンを産生するように作製されたMDS42細胞株による、スレオニン産生を示す。
図2は、MDS42のrelAを、relA遺伝子内の547の位置でGからAへのトランスバージョンを含む1つの点変異を含む変異relA遺伝子で、置換するスキームを示す。]
[0011] 発明の詳細な説明
本発明は様々ね形態で実施され得るが、いくつかの態様についての以下の記載は、本開示が本発明の例示として考慮され、示された特定の態様に本発明を限定することを意図するものではない、ことを理解されたい。見出しは、便宜のみのためであり、本発明を少しも限定するものと解釈するべきではない。いずれかの見出しに示された態様は、いずれかの他の見出しに示された態様と組合わせてよい。]
[0012] 本明細書に記載の数字又はデータの何れかによって形成され得る任意の範囲、割合又は割合の範囲は、本発明の更なる態様を示すものと理解されたい。このことは形成され得る範囲を含み、これは上限及び/又は下限を含むか又は含まない。従って、当業者は、割合、範囲及び割合の範囲のような多くのものが本明細書に記載のデータ及び数字から明確に導かれ、すべてが本発明の態様を示す、ことを理解することになる。]
[0013] 本発明の化合物、生成物、及び組成物及び方法が開示され記載される前に、本明細書で使用される用語が、特定の態様を記載する目的に使用され、限定するものではない、ことを理解されたい。本明細書及びクレームで使用される単数形「a」、「an」及び「the」は、他に明確に示さない限り、複数形を含む。]
[0014] 以下の表1〜4は、変異relADNA配列を示す。]
[0015] 表1は、位置547でのG→A変異を含むE.コリrelAコーディング配列を示す（配列番号1）。変異したアミノ酸に下線を引き、太字で示す。]
[0016] ]
[0017] ]
[0018] 表2は、位置547でのG→T変異を含むE.コリrelAコーディング配列を示す（配列番号2）。変異したアミノ酸に下線を引き、太字で示す。]
[0019] ]
[0020] 表3は、位置548でのC→G変異を含むE.コリrelAコーディング配列を示す（配列番号3）。変異したアミノ酸に下線を引き、太字で示す。]
[0021] ]
[0022] ]
[0023] ]
[0024] 表4は、位置548でのC→T変異を含むE.コリrelAコーディング配列を示す（配列番号4）。変異したアミノ酸に下線を引き、太字で示す。]
[0025] ]
[0026] ]
[0027] 1つの実施態様では、本発明は、単離DNA、すなわち、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4又はその相補配列のいずれか1つを含む又はそれからなるヌクレオチド配列を提供する。]
[0028] 別の実施態様では、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4又はその相補配列のいずれか1つを含む又はそれからなる単離核酸を提供する。]
[0029] 別の実施態様では、本発明は、配列番号1、配列番号2、配列番号3、又は配列番号4のヌクレオチド配列（又はその相補配列）又はその縮重変異体を含むか又はそれからなる、単離核酸を提供する。]
[0030] 別の実施態様では、本発明は、発現制御配列に作動的に連結した配列番号1、配列番号2、配列番号3、又は配列番号4の核酸を含む、発現ベクター、例えばプラスミド、を提供する。別の実施態様では、本発明は、前記ベクターの1つを含む培養細胞を提供する。更に別の実施態様では、本発明は、前記ベクター又は前記細胞の子孫の1つでトランスフェクトされた培養細胞を提供する。]
[0031] 更に別の実施態様では、本発明は、relA遺伝子を含むゲノムを有する減少したゲノム細菌、例えばE.コリであって、該relA遺伝子が少なくとも1つの点変異を含む、細菌を提供する。関連した実施態様では、該変異は、relA遺伝子の位置547又は548にある。]
[0032] 更に別の実施態様では、本発明は、その天然の親株のゲノムよりも少なくとも5%、少なくとも8%又は少なくとも10%小さいように遺伝子工学的に作製されるゲノムを有する細菌であって、少なくとも1つのrelA変異を含む菌を提供する。1つの実施態様では、少なくとも1つのrelA変異は、relA遺伝子の位置547又は548で起こる。別の実施態様では、該変異は、以下：relA遺伝子の547の位置でのG→A点変異、relA遺伝子の547の位置でのG→T点変異、relA遺伝子の548の位置でのC→G点変異、又はrelA遺伝子の548の位置でのC→T点変異の1以上から選択される。別の実施態様では、該細菌は、該relA遺伝子の位置540と550との間で起こる、多くない複数、例えば1〜約10、1〜約8又は1〜約5のrelA点変異を含む。]
[0033] 1つの実施態様では、本発明は、1以上の減少したゲノム細菌を用いてアミノ酸を生合成するための方法であって、以下：(1)天然のrelA遺伝子を含むDNAを有する細菌を提供し；(2) 該天然のrelA遺伝子を変異relA遺伝子と置換して、relA変異細菌を形成し；及び(3) 該変異relA細菌からアミノ酸を発現させること、を含む、方法を提供する。1つの実施態様では、該アミノ酸は、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Val、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr及びTrpからなる群より選択される。]
[0034] 定義
本明細書で使用される「塩基対」とは、例えば、二重鎖DNA分子におけるアデニン(A) とチミジン(T)、又はシトシン(C) とグアニン(G) の水素結合ヌクレオチドを言うことがある。RNAでは、ウラシル(U) はチミンと置換される。塩基対は、DNA長の測定単位として使用されることもある。]
[0035] 「クローン」は挿入配列に関連して使用され、ベクターはベクターへの挿入配列のライゲーション、あるいは相同な、部位特異的な又は場合によって正式に認められていない組換えによるその導入を意味することがある。挿入配列、ベクター及び宿主細胞に関してして使用される場合に、該用語は、所定の挿入配列のコピーを作製する意味がある。該用語は、クローン化挿入配列を有する宿主細胞又はクローン化挿入配列そのものを言うこともある。]
[0036] 本明細書で使用される「相補（complement）」、「相補的な」又は「相補性」は、核酸分子のヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ間のワトソン-クリック又はフーグステン型塩基対を意味することがある。例えば、配列5'-A-G-T-3'は、配列3'-T-C-A-5'に相補的である。相補性は、「部分的」でよい、そこでは、塩基対ルールに従ってヌクレオチドのいくつかのみがマッチする。あるいは、核酸間で「完全な」又は「総合的な」相補性が存在する場合もある。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの能力及び強度に対する影響を有することがある。]
[0037] RNAへの転写及びタンパク質への次の翻訳に際して、核酸がヌクレオチドの配列を意味することがあることに関連して本明細書で使用される「コードする」又は「コードする（coding）」は、所定のタンパク質、ペプチド又はアミノ酸配列の合成を導くことになる。かかる転写及び翻訳は、インビトロ又はインビボで実際に起こってもよく、又は標準的な遺伝子コードに基いて厳密に理論的でもよい。]
[0038] 本明細書で使用される「酵素」は、他の化合物の化学的変化を誘導するための触媒として働き、それによって、1以上の基質から1以上の生成物を製造する、タンパク質を意味することがある。酵素は、本明細書では標準的な命名を用いて、又は2004年3月11日のNomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biologyによって推奨されているそのEC番によって言及される。]
[0039] 本明細書で使用される「発現制御配列」は、それに作動可能に連結された核酸の転写を指向する転写因子結合部位のプロモーター又はアレイを意味することがある。]
[0040] 二重鎖核酸に関連して使用される「遊離末端」は、ブラント遊離末端もしくは粘着性末端又はその組合せを有する線状核酸を意味することがある。]
[0041] 本明細書で使用される「遺伝子」は、それに対するポリペプチド又は前駆体をコードする核酸配列を含む、核酸（例えば、DNA又はRNA）を言うことがある。該ポリペプチドは、完全長又は断片の所望の活性又は機能性（例えば、酵素活性、リガンド結合、シグナル形質導入、抗原性等）が保持される限り、完全長コーディング配列又は該コーディング配列の任意の部分によってコードされ得る。該用語はまた、該遺伝子が完全長mRNAに転写されるのに寄与する5’及び3’末端のコーディング領域に隣接する配列を包含する。用語「遺伝子」は、遺伝子のcDNA及びゲノム形態を包含する。遺伝子のゲノム形態又はクローンは、（例えば、イントロン）と称される非-コーディング配列で妨害されたコーディング配列を含むことがある。]
[0042] 核酸を株に加えることに関連して使用される「導入する」又は「導入された」は、核酸が、該株の染色体に統合されるか、又は該株中にプラスミドのようなベクターに含まれてよいことを意味する。]
[0043] 本明細書で使用する「ライブラリ」は、それぞれ挿入配列を含む複数のベクター、又は複数のヌクレオチド断片を言うことがある。]
[0044] 本明細書で使用する「変異体」又は「変異誘発」は、親株の核酸への任意の改変を意味することがある。核酸の変異誘発は、任意の種類でよく、削除、挿入、置換、再配列、並びにサプレッサー及び点変異を含むがこれらに限定されない。]
[0045] 本明細書で使用する「核酸」は、DNA又はRNAを含むがこれらに限定されない分子を含む任意の核酸を意味することがある。該用語は、4-アセチルシトシン、8-ヒドロキシ-N6-メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、プソイドイソシトシン、5-(カルボキシヒドロキシメチル)ウラシル、5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルアデニン、1-メチルプソイドウラシル、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-メチルアデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、y-D-マニノシルキューオシン、5'-メトキシカルボニルメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、オキシブトキソシン、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、N-ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸、プソイドウラシル、キューオシン、2-チオシトシン、及び2,6-ジアミノプリンを含むがこれらに限定されないDNA及びRNAの任意の塩基アナログを含む配列を包含する。]
[0046] 本明細書で使用する「ヌクレオチド」は、ペントース糖部分、リン酸基及び窒素含有へテロ環式塩基からなる核酸（例えば、DNA又はRNA）を言うことがある。該塩基は、グリコシド炭素（ペントースの1'炭素）を介して糖部分に連結されることがある。塩基及び糖の組合せは、ヌクレオシドと称されることがある。ヌクレオシドがペントースの3'又は5'に結合されたリン酸基を含む場合には、ヌクレオチドと称されることがある。作動可能に連結したヌクレオチドの配列は、「塩基配列」又は「ヌクレオチド配列」又は「核酸配列」と称され、左から右への方向が、従来の、5'末端から3'末端の方向である形式によって本明細書では表現されることがある。]
[0047] 本明細書で使用される「作動可能に連結した」は、下流ポリヌクレオチドの生産的転写が発現制御配列で開始されるな、発現制御配列及び下流ポリヌクレオチドを言うことがある。]
[0048] 本明細書で使用される「過剰発現」は、遺伝子によってコードされるタンパク質の総細胞活性が増加することを意味することがある。タンパク質の総細胞活性は、タンパク質の増加した細胞量、又はタンパク質の増加した半減期に因ることがある。タンパク質の総細胞量は、該タンパク質をコードする遺伝子の増幅、又は該タンパク質をコードする遺伝子に強力なプロモーターを作動可能に連結することを含むが、これらに限定されない方法によって増加することがある。]
[0049] 本明細書で用いる「タンパク質」は、天然又は組換えのいずれかの、ペプチド、ポリペプチド及びタンパク質、並びにその断片、誘導体、ホモログ、変異体及び融合体を意味することがある。]
[0050] 本明細書で使用される「比較領域」は、ゲノムに関しては、1x107、1.5xlO7、2xlO7、2.5xlO7、3xlO7、3.5xl06、4xlO7又はそれ以上のヌクレオチドもしくは塩基対を言い、核酸配列に関しては、50、100、250、500、103、5xlO3、104、5xlO4、105、5xlO5、106>はそれ以上のヌクレオチドもしくは塩基対を言う。]
[0051] 本明細書で使用される「ストリンジェントハイブリダイゼーション条件」は、例えば核酸の複合体として、第1の核酸配列が第2の核酸配列と特異的又は選択的にハイブリダイズし、他の配列にはハイブリダイズしない条件を意味することがある。ストリンジェント条件は、配列依存的であり、異なった環境では異なることになる。一般的に、ストリンジェント条件は、特定のイオン強度pHでの特定の配列について熱融解点（Tm）よりも5〜10℃低いように選択される。Tmは、第1配列の50%が平衡状態（第2配列がTmで過剰に存在する場合には、第1配列の50%が平衡状態にある）の第2配列にハイブリダイズする温度（特定のイオン強度、pH及び核酸濃度）でよい。ストリンジェント条件は、塩濃度が、pH 7.0〜8.3で約1.0 Mナトリウムイオン濃度、典型的には約0.01〜1.0 Mナトリウムイオン濃度（又は他の塩)よりも低く、そして、温度が、短い核酸配列（例えば、約10〜50ヌクレオチド）について少なくとも約30℃であり、長い核酸配列（例えば、約50超のヌクレオチド）について少なくとも約60℃ある、条件である。ストリンジェント条件は、ホルムアルデヒドのような不安定化剤を添加することによって達成してもよい。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションのために、陽性シグナルは、バックグランドハイブリダイゼーションの少なくとも2〜10倍でよい。具体的なストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、以下を含む：50%ホルムアミド、5xSSC及び1% SDS、42℃でのインキュベーション又は5x SSC、1% SDS、65℃でのインキュベーション、及び65℃での0.2xSSC及び0.1% SDSによる洗浄。]
[0052] 本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、第1配列が、比較領域について、第2配列の相補配列と少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%同一であるか、あるいは、第2配列がストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味することがある。]
[0053] 本明細書で使用される「実質的に同一」とは、第1配列及び第2配列が、比較領域について、少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%同一であるか、あるいは実質的に相補的であることを意味することがある。参照配列及び試験配列を手動で又はコンピュータアルゴリズム（例えば、GAP、BESTFIT、FASTA及びTFAST）によって並べ、「同一性残基の総数」を「参照配列の残基の総数」によって割って100を掛けることによって、同一性のパーセンテージを計算することができる。]
[0054] 減少したゲノム株
天然環境にある細菌は、標準的な工業的又は研究室的な成長では通常経験されない多くの条件に曝露され、そのため、多数の条件依存的なストレス誘発遺伝子、又は他の生物の工業的又は研究室的な使用では必要とされないことがある本質的でない遺伝子を有する。細菌のゲノムに含まれる多数の遺伝的情報が、工業的又は研究室的な重要性のプロセスにおいて細菌培養の使用に対して有害な効果を与えることなく、削除されることが知られていた。減少したゲノムを有する細菌は、多くの工業的及び研修室的な用途において天然の株よりも有利であり得ることも理解されていた。例えば、減少したゲノムを有する細菌は、少なくともいくらか代謝要求性であり、そのため、所望の生成物をより効率的に産生することができる。加えて、減少したゲノムは、より少ない天然物及びより低レベルの特定の天然タンパク質をもたらし、残り細菌タンパク質からの所望のタンパク質の精製を容易にする。更に、細菌の遺伝子的配列の中には、標準的な工業的又は研究室的な実施を妨害する不安定物質（instabilitie）と関連し、コストがかかり厄介な制御手段を伴うかもしれないものがある。]
[0055] 減少したゲノム株は、その天然の親株のゲノムよりも、少なくとも2パーセント（2%）、5パーセント（5%）、7パーセント（7%）〜8パーセント（8%）〜14パーセント（14%）〜18パーセント（18%）〜20パーセント（20%）、40パーセント（40%）〜60パーセント（60%）小さいゲノムを有することがある。ゲノムが一連の削除の後に小さくなるパーセンテージは、「すべての削除後に削除された塩基対の総数」を「すべての削除前の親株のゲノム中の塩基対の総数」で割って100を掛けることによって計算される。]
[0056] 減少したゲノム株は、そのタンパク質をコードする削除遺伝子の、約5%〜約10%、約10%〜約20%、約30%〜約40%、又は約60%を有するゲノムを有してもよい。ゲノムがタンパク質をコードする削除遺伝子を有していたパーセンテージは、「すべての削除後に削除されたタンパク質をコードする削除遺伝子の総数」を「すべての削除前の親株のゲノム中のタンパク質をコードする削除遺伝子の総数」で割って100を掛けることによって計算される。]
[0057] ゲノムから削除された遺伝子及び他の核酸配列は、特定の成長条件下で減少したゲノム株の生存及び増殖の速度に逆の影響を及ぼさないことがある。逆の効果のレベルが許容できるか否かは、具体的な適用に依拠する。例えば、増殖速度の30%減少は、1つの適用には許容されるが、別の適用には許容されないことがある。加えて、ゲノムからの核酸配列の削除の逆効果は、培養条件を変えるような手段によって減少することがある。かかる手段は、許容されない逆効果から許容される効果に転じることがある。増殖速度は、増加するか又は親株とほぼ同じである。増殖速度はまた、親株の速度よりも約5%、10%、15%、20%、30%、40%〜約50%である。減少したゲノム株の倍加時間は、約30分から約3時間の範囲でよい。]
[0058] 親
親株は、任意の細菌株又は他の生物、及び減少したゲノム株が由来する中間株でよい。親株の代表的な例は、E.コリ、例えばK-12又はB、あるいは親株のそれと実質的に同一のゲノム配列を有する株を含むが、これらに限定されない。K-12株は、MG 1655でよい。親株のゲノムのヌクレオチド配列は、部分的に又は完全に知られていてよい。E.コリ及び他の通常使用されている研究室的な微生物の数種類の株の完全なゲノム配列は、知られている（例えば、Blattner他, Science, 277: 1453-74, 1997;GenBank受入番号U00096; Perna他, Nature, 409, 529-533, 2001; Hayashi他, DNA Res., 8, 11-22, 2001; Welch他, Proc. Natl. Acad. Sci, USA 99: 17020-17024, 2002、及びGenBank受入番号AE014075参照。これらは参照として本明細書に引用されている）。]
[0059] E.コリMG1655（注釈付きm56変形体）（NCBI受入番号U00096.1）の核酸配列は、総サイズが4,639,675個のヌクレオチド又は塩基対を有する。E.コリMG1655のゲノム配列の最初の公表は、m56変形体（4,639,221個のヌクレオチド又は塩基対）と注釈された。E.コリMG1655ゲノムの最初の公表で現れると予測された各遺伝子は、小文字の「b」で始まる独自の番号識別子に帰属された。最初の予測された遺伝子はb0001を有するthrLであり；最後の遺伝子はb4403を有するlasTであった。最初の公表から、様々なグループによって「a」又は「.1」の接尾語を付けて非公式のb-数を与えられた数個の新規遺伝子例えばyaa Vが見出されている。これらの遺伝子の中には、ごく最近の注釈（変形体m56）において受け入れられたものもあり、b4404から開始する帰属された新規b-番号を有するものもある。m54変形体中の数個の遺伝子は、その後、配列決定エラーによって一緒になるか又は分かれている。これらはすべて、b4460〜b4500の新規のb-番号を与えられており、古いb-番号は受入削除されている。]
[0060] ゲノム削除
減少したゲノム株は、本明細書に参照として引用されている国際特許出願公開第WO 2007/024756号の表1に記載の核酸領域の1以上、又はそれと実質的に同一の配列を欠いてよい。WO 2007/024756の表1は、E.コリMG1655（注釈付きm56変形体）用のゲノムの以下の注釈特徴を提供する：カラム1（タイプ）は、注釈特徴のタイプを挙げている（コーディング配列（CDS）、プロファージ、rep_origin、繰返領域、rRNA、tRNA、misc_RNA、又はmisc_feature）；カラム2（S）は、参照鎖（+:フォワード、-: 相補）；カラム3（左）は、特徴の左端の位置を示す；カラム4（右）は、特徴の右端の位置を示す；カラム5（名前）は、特徴の名前を示す；及びカラム6（B）は、特徴のb-番号のブラットナ（Blattner）番号を示す。減少したゲノム株は、MDS41、MDS42、MDS43、MDS44、MDS45、MDS46、MDS47、MDS48、MDS49、MDS50、MDS51、MDS52、MDS53、MDS54、MDS55、MDS56、MDS57、MDS58、MDS59、MDS60、又はそれと実質的に同一のゲノムを有する株でよい。減少したゲノム株は、MDS42recA-でも、又はそれと実質的に同一のゲノムを有する株でもよい。]
[0061] 削除され得る核酸配列の1種は、その生物の安定性又はその生物の遺伝子産物に逆の影響を与えることがあるものを含む。不安定性を招くかかる要素は、置換可能な要素、挿入配列、及びゲノムの不安定性に機能することがある他の「利己的DNA」要素を含む。これらの要素は、完全であれ又は欠陥があれ、ゲノム中の1つの点から別の点、あるいはベクターのような細胞中で他の核酸配列に移動することがある。これらの要素は、培養環境において細菌生存及び成長に重要でないかもしれない。E.コリMG1655（注釈付きm54変形体）ゲノムマップ上のIS要素の位置は、本明細書に参照として引用されている、米国特許出願公開第20030138937号及び国際特許出願公開第WO 2003/070880号の図1及び表1に示されている。ゲノムの不安定性に関連した他の核酸配列が削除されてもよい。]
[0062] 削除され得る核酸配列の別の種類は、制限修飾系遺伝子、及びその産物外来DNAを破壊することがある他の内因性ヌクレアーゼである。これらの遺伝子は、培養環境において細菌生存及び成長のために重要でないことがある。これらの遺伝子は、細菌に挿入されたベクターを破壊することによる遺伝子操作を妨害することもある。E.コリMG1655（注釈付きm54変形体）ゲノムマップ上の制限修飾系遺伝子の位置は、本明細書に参照として引用されている、米国特許出願公開第20030138937号及び国際特許出願公開第WO 2003/070880号の図1及び表1に示されている。ゲノムの不安定性に関連した他の核酸配列が削除されてもよい。非相同遺伝子を含むDNAメチラーゼ遺伝子は、ある用途、例えば真核細胞メチラーゼ遺伝子のための株を最適化するように、削除された株に戻されることがある。]
[0063] 削除され得る核酸配列の別の種類は、細菌の運動性を与えることがある鞭毛遺伝子ファミリーである。培養環境では、細菌の運動性は、細胞生存及び成長に重要ではなく、泳ぐ行動は代謝的に非常に高くつき、細胞エネルギーの1%超が無駄に消費され得る。E.コリMG 1655（注釈付きm54変形体）の遺伝子マップ上の鞭毛遺伝子の位置は、本明細書に参照として引用されている米国出願公開第20030138937号及び国際特許出願公開第WO 2003/070880号の図1及び表1に示されている。]
[0064] 削除され得る核酸配列の別の種類はRhs要素である。Rhs要素は、3.7 Kb Rhsコアを共有していることがあり、このコアは、相同組換えを介するゲノム配列のための手段を提供する大きな相同反復領域（E.コリK-12において5コピーが存在し得る）であってよい。Rhs要素は、いくつかの他の背景において大きく進化した補助的要素であり、生物種としてのE.コリの分岐の後、水平方向の変化によってE.コリに伝播する。E.コリMG 1655（注釈付きm54変形体4）の遺伝子マップ上のRhs要素の位置は、本明細書に参照として引用されている米国出願公開第20030138937号及び国際特許出願公開第WO 2003/070880号の図1及び表1に示されている。]
[0065] 削除され得る核酸配列の別の種類は、細胞生存及び増殖のためにそれほど重要でないことがある非-転写領域である。削除され得る核酸配列の別の種類は、主な制限修飾遺伝子ファミリーをコードすることがあるhsd領域である。コリMG 1655（注釈付きm54変形体4）の遺伝子マップ上の非-転写領域及びhsd領域の位置は、本明細書に参照として引用されている米国出願公開第20030138937号及び国際特許出願公開第WO 2003/070880号の図1及び表1に示されている。]
[0066] 削除され得る核酸配列の他の種類は、プロファージ、偽遺伝子、毒素遺伝子、病原性遺伝子、ペリプラスムタンパク質遺伝子、膜タンパク質遺伝子、及びバクテリオファージ受容体、例えば細胞溶解ファージT1の受容体をコードする[tonA]（FhuA）及び/又はその完全なオペロン[fhu]ABC、を含む。]
[0067] 削除され得る核酸配列の他の種類は、1つの細菌株のゲノムを1以上の他の株と比較することによって特定してよい。該株の2以上に存在しない核酸配列は、機能的にほとんど必須でない可能性があり、そのため削除の候補となることがある。E.コリK-12（Blattner他、前掲参照）がその近い関係にある0157:H7（Perna他、前掲参照）の配列と比較した後、タンパク質コーディング遺伝子の22%（K-12）及び46%（(0157:H7）が、比較的一定の骨格に無作為に挿入された1〜約85kbの株-特異的島に存在し得ることが発見された。本明細書に参照として引用されている、米国特許出願公開第20030138937号及び国際特許出願公開第WO 2003/070880号は、約8%小さいゲノムを有する細菌株を与える12個の標的の同定及び削除をもたらす、E.コリ株0157:H7 EDL933及びK-12 MG1655のゲノムの比較を記載している。減少したゲノムを有する細菌は、天然の親MG 1655株と実質的に同一の速度で成長する。]
[0068] 尿路疾患性E.コリ株CFT073 H7（Welch他、前掲参照）のDNA配列は、最近決定され、その配列はK-12（MG 1655）及び0157:H7と比較された。結果は、該ゲノムのいずれか1つに見出されたすべてのコーディング遺伝子の約40%のみが、該ゲノムのすべてに存在し、CFT073、K-12及び0157:H7が67%、43%及び68%の株特異的島遺伝子から成る、ことを示している。この情報に基づいて、タンパク質コーディング配列の約60%と同じ量が、E.コリから削除されることがある。ある1つの株での成長のためであり、他の株では成長のために必要とされない、必須の遺伝子が存在することは注目すべきことである。かかる場合には、該株の成長のために必須の遺伝子は、該株から削除されないか、あるいは削除される場合には、該株の成長を許容するように、相補的機能を有する別の遺伝子と置換されることがある。]
[0069] 削除され得る核酸配列の他の種類は、ペリプラスムタンパク質をコードする遺伝子である。グラム陽性菌、例えばE.コリは、2つの細胞膜、内側細胞膜、及びペリプラスム空間（PS）によって分離されている他の外側細胞膜を有している。本明細書に参照として引用されている国際特許出願公開第WO 2003/070880号に示されているように、9個の公知の及び3個の推定上のペリプラスムタンパク質遺伝子は、最小培地で成長する生物の能力に著しく影響を与えることなく、MDS40を構築する際に成功的に削除された。これらの変異は、アミノ酸取り込み、無機代謝物、細胞膜維持、糖代謝、及び接着を含む機能の範囲に影響を与える。ペリプラスムタンパク質の除去は、ペリプラスムで発現された組み換えタンパク質中の汚染を減少させることがある。]
[0070] そのシグナルペプチド配列によって特定された、公知の又は推定上の膜タンパク質をコードする約85個の遺伝子が削除されている。これらの内、33個の遺伝子は、鞭毛構造又は生合成に関連し；9個は、線毛構造又は生合成に関連し；及び13個は、一般的な分泌経路に関連し得る。残りの遺伝子は、細胞膜において様々な公知又は推定上の機能を有することがある。これらのタンパク質の多くは、ペリプラスム空間においてプロセスされることがある。本明細書に参照として引用されている国際特許出願公開第WO 2003/070880号に示されているように、それらも、最小培地で成長する生物の能力に顕著に影響を与えることなく、MDS40を構築する際に削除されている。]
[0071] 注釈付きのMG 1655データベースにおけるシグナルペプチド-様配列、及びこれらと文献との交差関連性を検索することによって、現存し得るペリプラスムタンパク質である181個のタンパク質が同定されている。多数のこれらのタンパク質は、機能に従って、数種類のグループ：接着及び運動；栄養及び塩の取り込み、微量元素の取り込み；環境センシング；防御及び保護:並びにペリプラスムタンパク質分泌及びプロセシングに分類されている。削除され得る遺伝子又は完全なオペロンの中には、例えば生物薬剤製造のために定義された最小培地においては必要とされないかもしれない、糖及びアミノ酸輸送タンパク質をコードするものが存在する。]
[0072] 1もしくは数個の遺伝子又は他の核酸配列のゲノムからの削除の結果を試験することができる。例えば、ゲノムの1もしくは数個の遺伝子又は他の核酸配列が削除された後、得られた細菌の生存及び増殖速度を測定することができる。上記の特定された遺伝子又は他の核酸配列のほとんどは、所望の産物を産生する目的のために有害な効果なしに削除され得るが、特定の遺伝子又は他の核酸配列の削除が、細胞死のような許容されない結果又は増殖速度の許容されないレベルの減少を有する可能性がある。この可能性は、遺伝子機能及び生物学的経路間の相互作用の重複のために存在している。更なる削除なしに株中で生存可能な削除の中には、他の削除と組み合わせた場合のみ有害なものがある。その可能性は、削除候補を特定するために使用される特定の方法によっても存在する。例えば、削除候補を特定するために使用される1つの方法は、2つのE.コリ株を比較して、2つの株に存在しない遺伝子又は他のDNA配列を選択することである。これらの遺伝子及び他のDNA配列の大部分は、機能的に必須でない可能性があるが、それらの中には、固有の株に重要なものがある。削除候補を特定するために使用される別の方法は、非-転写領域を特定することであり、ある非-転写領域がゲノム安定性に重要である可能性が存在する。]
[0073] 試験される1つもしくは数個の遺伝子又は他のDNA配列の削除の結果は、適用の目的に依拠する。例えば、多くの適用に当てはまる高い産生効率が主な関心事である場合には、増殖速度及び培地消費速度に対する削除の効果は、試験された結果であり得る。この場合には、試験された結果はまた、特定の産物の細胞当たりの産生速度及び産生量としてより特異的であり得る。天然タンパク質汚染を除くことが主な関心事である場合に、より少ない天然タンパク質及びより低い天然タンパク質レベル、又は特定の天然タンパク質の非存在は、試験された結果であり得る。]
[0074] 遺伝子又は他のDNA配列を削除する結果を試験することは、該遺伝子又は該DNA配列についてほとんど知られていない場合に重要であることがある。このことは、減少したゲノムで細菌を作製する点で、削除候補を特定する別の実行可能な方法である。この方法は、他の方法によって特定された候補が削除され、そして追加の候補が探索される場合に、特に有用である。]
[0075] 遺伝子又は他のDNA配列を削除する結果が1つの条件セット下で細菌の生存性に影響を有する場合には、特定の遺伝子又は他のDNA配列を削除しない他の方法は、有害な効果を緩和することができる手段が存在するかどうかを決定することである。例えば、LPSタンパク質の膜貫通型ドメインの細胞膜での非存在によって起こるより多孔製の細胞膜に起因して、リポ多糖（LPS）遺伝子の削除が低生存をもたらす場合には、培養条件は、LPS遺伝子を欠く細菌が生存するだけでなく、LPS遺伝子を担持できるように、上記のより多孔性の細胞膜を提供するために変更することができる。]
[0076] 削除を作製する方法
本株は、ゲノム核酸を削除するための当業者に公知の数種類の方法の任意を用いて、核酸配列を削除することによって作製してよい。核酸配列は、削除部位での任意の他の変異を生じることなく、そして任意の挿入された核酸を残すことなく（傷を残さない削除）、ゲノムから削除してよい。数種類の連続した削除が細菌ゲノムから作製される場合には、任意の挿入された核酸配列を残さないことが重要であろう。かかる挿入された配列は、それらが残された場合には、残りのゲノムの特徴付けられてなくかつおそらく重要な部分を細菌から削除するか、又は、他の予測しないゲノム再配列を悪影響を持って起こすことになる、望ましくない組換え事象、のための候補部位となることがある。]
[0077] 細菌のゲノムにおいて削除を作製する代表的な方法は、各々が本明細書に参照として引用されている、米国特許出願公開第20030138937号、国際特許出願公開第WO 2003/070880号、Posfai, G.他、J Bacteriol 179: 4426-4428 (1997)、Muyrers, J.P.P.他、Nucl AcidsRes. 27: 1555-1557 (1999)、Datsenko, K.A.他、Proc. Natl Acad. Sci 97: 6640-6649 (2000)、及びPosfai, G.他、Nucl Acids Res. 27: 4409-4415 (1999) に記載されている。削除方法は、線状DNAに基づく方法及び自殺プラスミドに基づく方法に分離される。Muyrers, J.P.P.他、Nucl. Acids Res. 27: 1555-1557 (1999) 及びDatsenko, K.A.他、Proc. Natl Acad. Sci. 97: 6640-6649 (2000) に開示されている方法は、DNA-型法であり、Posfai, G.他、J Bacteriol 179: 4426-4428 (1997) 及びPosfai, G.他, Nucl Acids Res. 27: 4409-4415 (1999) に開示されている方法は、自殺プラスミド-型法である。]
[0078] 方法
減少したゲノム株は、所望の産物、例えば組換えタンパク質、核酸、治療生成物、代謝中間体及び最終産物、の産生のために使用されることがある。組換えタンパク質の代表例は、インシュリン、インターロイキン、サイトカイン、成長ホルモン、成長因子、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、インターフェロン、抗体及び抗体断片を含むがこれらに限定されない。治療生成物の代表例は、ワクチン成分、診断生成物又は研究試薬を含むがこれらに限定されない。代謝中間体及び最終産物の代表例は、アミノ酸、脂肪酸、ビタミン等、及び細菌中で実際に産生されていないが代謝経路工学又は他の遺伝的操作の結果として産生された化学化合物を含むが、これらに限定されない（例えば、本明細書に参照として引用されている米国特許第6,472,16号明細書及び同第6,372,476号参照）。]
[0079] 組換えタンパク質は、ペリプラズム又は細胞質に発現されることがあり。ペリプラズムでのタンパク質の発現は、工業的目的のために通常使用され、そして本明細書に参照として引用されている、Hanahan, [J. Mol Biol], 166: 557-80, 1983; Hockney, [TrendsBiotechnoL], 12: 456-632, 1994; 及びHannig他, [Trends Biotechnol], 16: 54-60, 1998においてレビューされる。組換えタンパク質は、ペリプラスム空間に分泌を起こすシグナルポリペプチドに結合されている融合タンパク質を発現することによって、ペリプラズム中で産生されることがある。シグナルペプチドは、特定のシグナルペプチダーゼによって開裂されることがある。]
[0080] ペリプラスム発現のために有用な構築物は、所望のタンパク質をコードする第2核酸配列に作動的に連結したペリプラスム空間へのタンパク質の輸送を介在することができるシグナルペプチドをコードする第1核酸配列を含むことがある。シグナルペプチドは、発現されるタンパク質に本来的であってよい。ペリプラスム空間に輸送されたタンパク質は、生物学的に活性であり得る。組換え構築物の発現は、宿主細胞で構成的に発現されている誘導プロモーター又はプロモーターの制御下にあってよい。誘導プロモーターの使用は、飽和性であり得るSec系を用いる場合に有利である。例えば、[lac]-型プロモーター/レプレッサは、非-代謝的ガラクトース誘導体IPTGによって誘導可能であり、これを使用してよい。かかるプロモーターは、Sec系を介して発現及び分泌の精密な調節を可能にすることができ、それによってペリプラスム発現を最適化する。]
[0081] 組換えタンパク質は、組換えタンパク質の好適な折り畳みを提供することができるシャペロン/ジスルフィド結合形成酵素で共発現してもよい。組換えタンパク質のペリプラスム発現のために有用な核酸配列は、本明細書に参照として引用されている、米国特許第5,747,662号明細書、同第5,578,464号明細書及び同6,335,178号明細書及び同6,022,952号明細書；Thomas他, Mol-Micro [Mol-Micro](2001) 39 (1) 47-53; Weiner他, [Cell], (1998) 93, 93-101; 及びCurrent Protocols in Molecular Biology [Current Protocols in Molecular Biology](1994) 16.6.1-16.6.14 (John Wiley他及びSonsによる2000年商標権) に記載の核酸を含むがこれらに限定されない。]
[0082] 減少したゲノム株は、核酸をクローン化又は増幅するために使用されてよい。減少したゲノム株は、高量の核酸の産生を可能にすることがある、明瞭で最小の遺伝的背景を提供することがある。IS要素のような利己的DNA要素を欠く減少したゲノム株は、他の毒素遺伝子のクローニングを可能にすることもある。減少したゲノム株は、ゲノムライブラリのようなライブラリを作製するために使用されてもよい。]
[0083] 減少したゲノム株は、ワクチンで接種された宿主において免疫応答を誘導することができる抗原をコードする非相同遺伝子を導入することによってワクチンとして使用されてもよい。減少したゲノムワクチンは、宿主において所望の生理学的な反応（すなわち、免疫応答）を誘導することができることが知られているDNAを含むDNA型ワクチンでよい。]
[0084] 大量のスレオニンを産生することができるMDS42は、減少したゲノム細菌への対する変更を作製することによって産生された。これらの変化は、tdh、すなわち、分解性スレオニンデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を削除し、及び組換えtacプロモーターによって作動可能に制御された該スレオニン生合成遺伝子thrABCを含むプラスミドを導入すること、を含む。このプラスミド上のthrA遺伝子は、ホモセリンデヒドロゲナーゼのフィードバック耐性体をコードする。本株によるスレオニン産生は、lad遺伝子の削除によって更に改善されて、プラスミド担持thrABC遺伝子の発現を低下させる。変異スレオニン及びホモセリントランスポーターをコードする、最終的な変異体、すなわちrhtA23は、培地中のスレオニンの分泌を増加させる。得られた株は、図1の42-最終物と称される。]
[0085] 株を過剰産生する商業的スレオニンの転写制御のマイクロアッセイ分析は、細胞が飢餓状態に永久に固定されたことを示した。このことは、ストリンジェント反応の正常な制御はこれらの株で失われていることを示唆している。これらのデータは、我々に、ストリンジェント反応を制御することに関連するタンパク質をコードする遺伝子の変異を容易に見つけさせた。2つの遺伝子は、元々研究の対象とした。RelA遺伝子は、荷電したアミノアシルtRNAの利用性をセンシングする中枢的役割を担い、RNAポリメラーゼを後に阻害するppGppを産生する。それによって、ストリンジェント制御を開始する。第2の遺伝子、spoTは、ppGppを分解することに関連し、それによってppGppの細胞内レベルを制御することによってストリンジェント反応を間接的に制御する。relAの具体的変異は、AlaのThrへの変異をもたらす(G→A)547に発見された。比較的些細な変化に思えるが、該残基は、該タンパク質の構造的モデルの主な構造的特徴を示す裂け目内に深く存在する。この裂け目はおそらく酵素の活性部位を示す。]
[0086] MDSD42-最終物によって産生されたスレオニンを増加するこの変異体の能力は、該変異をMDS42-最終物に導入することによって研究した。該遺伝子は、図2に概略する方法によって作製した。簡単には、変異配列を含む変異relA遺伝子の領域を含むPCR断片は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子に連結されるように組み立てた。線状PCR断片は、ラムダred-gamリコンビナーゼ用遺伝子をコードするプラスミドを含むMDS42-最終物に電気穿孔した。線状断片の組換えは、染色体上のrelA遺伝子を標的とし、それによって、クロラムフェニコール耐性relAメロジプロイドをもたらした。ラムダred-gamプラスミドは、クロラムフェニコール耐性細胞から処理し、該細胞は誘導I-Scelエンドヌクレアーゼを含むプラスミドで次いで形質転換した。該エンドヌクレアーゼの発現を誘導することは、クロラムフェニコール耐性細胞内のrelA遺伝子断片に隣接する二重鎖染色体分裂をもたらす。上記細胞が生存する唯一の方法は、染色体上に存在するrelAアレルを野生型配列から(G→A)547変異体配列に変換するために役立つ、relA遺伝子配列のrecA介在組換えによる方法である。組換えは、クロラムフェニコールへのその感受性によって特定する。プラスミドを含むI-Scelは、次いでクロラムフェニコール感受性細胞から処理し、該細胞はthrABC発現プラスミドで形質転換する。]
実施例

[0087] MDS42、MDS42-最終物及びMDS42-最終relA*によって産生されたスレオニンは、最少グルコース培地中の個々の株を静止相に成長させ、遠心及び濾過によって細胞を除き、次いで濾過殺菌済み培地を新鮮な最少培地に希釈し、スレオニン変異株の成長を支持する混合培地の能力を試験することによって、評価した。サンプル中の確実なスレオニンレベルは、実験サンプルの支持された成長と、公知の濃度の化学的に合成したスレオニンを用いて作成した標準曲線とを比較することによって決定する。図1に示す結果は、relA*変異体がMDS42-最終物株の能力を著しく増加させることを示している。このことは、relA*及び類似のrelA変異体が、高レベルのアミノ酸を産生するE.コリ株の能力を改善するという仮説を支持している。]

权利要求:

請求項1
単離されたDNAであって、そのヌクレオチド配列が、配列番号1、配列番号2、配列番号3もしくは配列番号4又はその相補配列のいずれか1つを含む、DNA。
請求項2
配列番号1、配列番号2、配列番号3もしくは配列番号4又はその相補配列のいずれか1つを含む、単離されたDNA。
請求項3
配列番号1、配列番号2、配列番号3もしくは配列番号4又はその縮重変異体の核酸配列を含む、単離されたDNA。
請求項4
発現制御配列に作動可能に連結された、配列番号1、配列番号2、配列番号3又は配列番号4の核酸を含む発現ベクター。
請求項5
請求項４記載のベクターを含む培養細胞。
請求項6
請求項４記載のベクターでトランスフェクトした培養細胞、又は該細胞の子孫。
請求項7
relA遺伝子を含むゲノムを含む減少したゲノム細菌であって、該relA遺伝子が少なくとも1つの点変異を含む、細菌。
請求項8
前記変異がrelA遺伝子の547〜548の位置にある、請求項７記載の減少したゲノム細菌。
請求項9
天然の親株のゲノムよりも少なくとも5%短いように遺伝子工学的に改変されているゲノムを有する細菌であって、少なくとも1つのrelA変異を含む、細菌。
請求項10
前記少なくとも1つのrelA点変異がrelA遺伝子の547〜548の位置で起こる、請求項９記載の細菌。
請求項11
前記点変異が、以下：relA遺伝子の547の位置でのG→A変異、relA遺伝子の547の位置でのG→T変異、relA遺伝子の548の位置でのC→G変異、又はrelA遺伝子の548の位置でのC→T変異の1以上から選択される、請求項９記載の細菌。
請求項12
アミノ酸の生合成の方法であって、以下：(1)天然のrelA遺伝子を含むDNAを有する細菌を提供し；(2) 天然relA遺伝子を変異relA遺伝子と置換して、relA変異細菌を形成し；及び(3) 該変異relA細菌からアミノ酸を発現すること、を含む、方法。
請求項13
前記アミノ酸が、Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Val、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Tyr及びTrpからなる群より選択される、請求項１２記載の方法。
請求項14
1以上の減少したゲノム細菌を用いてアミノ酸を生合成するための方法であって、以下：(1)天然のrelA遺伝子を含むDNAを有する細菌を提供し；(2) 該細菌に、プロモーターによって作動可能に制御されたアミノ酸のための1以上の生合成遺伝子を含むプラスミドを導入し；(3) 天然relA遺伝子を変異relA遺伝子と置換して、relA変異細菌を形成し；及び(4) 該変異relA細菌からアミノ酸を発現させること、を含む、方法。
請求項15
前記アミノ酸のための1以上の生合成遺伝子が、組換えtacプロモーターによって作動可能に制御されたthr ABCを含む、請求項１４記載の方法。